Objectif :
Cette UE a pour but de présenter les données théoriques et les approches techniques nécessaires à l'étude des interactions entre macromolécules dans leur contexte biologique. Le rôle essentiel des interactions protéine-protéine et protéine-acides nucléiques sera en particulier illustré par divers exemples biologiques (voies de transduction du signal, interaction antigène-anticorps, régulations géniques...).
Cours magistraux (24H) :
1/ Les protéines au centre des interactions entre macromolécules - Rappels sur les propriétés physicochimiques des protéines : propriétés d'ionisation et d'hydrophobicité des acides aminés, structure tridimensionnelle des protéines Le cas particulier des protéines membranaires - Modifications post-traductionnelles et leur rôle dans les interactions protéine-macromolécules biologiques - Les liaisons entre biomolécules, notion d'affinité et de spécificité, cinétique de l'interaction (constante d'équilibre et de dissociation)
2/ Les interactions protéine-protéine - Préparation et séparation des protéines d'intérêt (en particulier protéines recombinantes) : techniques de clonage dans différents systèmes d'expression, techniques de purification et d'analyse des protéines - Techniques d'étude des interactions protéine-protéine in vitro : Far western, GST pull down - Techniques d'étude des interactions in vivo : co-fractionnement chromatographique, pontage chimique, co-immunoprécipitation, double hybride, FRET - L'interactome : approches globales (double-hybride systématique, protéomique fonctionelle, approches génétiques) - Choix de la stratégie en fonction des paramètres connus
3/ Les interactions protéine-acides nucléiques et acide nucléique-acide nucléique - Rappels sur la structure des acides nucléiques et la régulation de l'expression des gènes - Les motifs protéiques de fixation de l'ADN, notions de domaines protéiques fonctionnels - Les interactions acide nucléiques-acide nucléique, rôle dans le contrôle de l'expression des gènes - Techniques d'étude des interactions protéine-acide nucléique et acide nucléique-acide nucléique : footprinting, gel-retard, simple hybride, ChIP, ChIP-ChIP, hybridation ADN-ARN, ARN-ARN....
4/ Les interactions protéines lipides : rappel sur les propriétés des lipides et les protéines membranaires, extraction des protéines membranaires, techniques d’études des interactions protéines lipides (ex : voie de l’insuline).
Travaux dirigés (8h) :
Illustration du cours sur la base d'analyse d'articles récents et de résultats scientifiques concrets.
Travaux pratiques (24h)
Les travaux pratiques auront pour but d’analyser les interactions protéine-protéine des sous unité de la protéine kinase A grâce à deux techniques différentes:
Production de protéines recombinantes chez E. coli et mise en évidence des interactions par GST-pull down (extraction de protéines, GST-pull down, SDS-PAGE et Western blot)
Analyse de l’interaction par le système du double hybride chez la levure(transformation de la levure, sélection, analyse des systèmes rapporteurs).
Ceci permettra à l’étudiant d’appréhender les avantages et les inconvénients de ces deux techniques tout en illustrant le contenu des cours de l’UE.
